Coloração de Gram
A coloração de Gram recebeu este nome
em homenagem a seu descobridor, o médico dinamarquês Hans Cristian
Joaquim Gram. Em 1884, Gram observou que as bactérias adquiriram cores
diferentes, quando tratadas com diferentes corantes. Isso permitiu
classificá-las em dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que
foram chamadas de Gram-positivas, e as que ficavam vermelhas, chamadas
de Gram-negativas. Após descrição do método, inúmeras propostas de
modificação foram feitas.
O
método tintorial predominante utilizado em bacteriologia é o método de
Gram. A bacterioscopia, após coloração pelo método de Gram com
diagnóstico presuntivo, de triagem, ou até mesmo confirmatório em alguns
casos, constituindo-se uma peça importante e fundamental. Essa técnica é
simples, rápida e tem capacidade de resolução, permitindo o correto
diagnóstico em cerca de 80% dos pacientes em caráter de pronto
atendimento em nível local.
Os
custos com investimento e manutenção são consideravelmente baixos diante
da eficácia alcançada com os resultados imediatos dos testes. Essa
técnica requer instalação simples, necessitando apenas de uma sala
pequena com disponibilidade de água e gás, onde deverá ser instalado um
balcão com pia e um bico de Bunsen, eventualmente substituído por uma
lamparina ou espiriteira. São ainda necessários: microscópio com
objetiva de imersão e bateria para a coloração de Gram. Os corantes
devem ser preparados pelo próprio laboratório ou por um laboratório
habitado que assegure a qualidade do produto. Finalmente, e mais
importante, são necessários técnicos de laboratório treinados,
responsáveis e conscientes do valor do seu trabalho.
Princípio
Nas bactérias Gram-positivas a
parede celular é formada principalmente por ácidos teicóicos e nas
bactérias Gram-negativas, é formada principalmente por lipídeos. Por
possuírem grande quantidade de ácidos teicóicos, após a coloração, as
Gram-positivas formam um complexo corado azul intenso, que não é
removido facilmente com álcool-acetona. As Gram-negativas não retêm a
coloração após o tratamento com álcool-acetona e são reveladas
posteriormente com solução de fucsina ou safranina, apresentando-se na
coloração avermelhada.
 |
As bactérias Gram-positivo apresentam uma parede espessa, homogénea, geralmente não estratificada e predominantemente constituída por peptidoglicano. Deste modo, o precipitado insolúvel que se forma por acção do mordente, fica retido no interior da célula pela camada espessa de peptidoglicano, logo, estas células não são descoradas permanecendo com a coloração conferida pelo corante primário (púrpura). |
| As bactérias Gram-negativo apresentam uma parede estratificada constituída por uma membrana externa e por uma camada mais interna que contém peptidoglicano e que é mais fina que a das Gram-positivo. Deste modo, o precipitado insolúvel, que se forma por acção do mordente, é removido (camada de peptidoglicano é mais fina que a das Gram-positivo e a membrana externa é parcial ou totalmente solubilizada pelo agente descolorante), pelo que as células ficam descoloradas, corando de vermelho pelo contrastante. |  |
|
Desta forma, a diferente
estrutura da parede bacteriana e, em particular a espessura
da camada de peptidoglicano, é a responsável pelo diferente
comportamento das bactérias face à coloração de Gram.
|
 |
O peptidoglicano é um heteropolímero rígido e insolúvel na água, constituído por cadeias lineares de dois açúcares aminados – NAG (ácido n-acetilglucosamina) e NAM (ácido n-acetilmurâmico) – ligados entre si por ligações glicosídicas. As cadeias lineares ligam-se entre si através de cadeias de quatro aminoácidos |
Variações
A técnica de coloração de Gram
geralmente respeita um protocolo de ações que a padroniza. Contudo, há
variantes nesse procedimento relacionadas aos tempos de execução da
coloração e à utilização de lavagem com água em dadas etapas que podem
ou não interferir na visualização das estruturas coradas.
Como
exemplo, o método original utiliza violeta-de-genciana. Hoje se utiliza
um outro tipo de cristal violeta, a violeta-de-metila. É importante
ressaltar que a solução de violeta-de-metila, em sua preparação, já
contém fixador químico. Entretanto, a modificação mais importante foi a
do corante secundário, também chamado de corante de fundo. A fucsina
fenicada de Gram foi substituída pela safranina baseado no espectro de
cores, já que esta última mantém-se mais distante da violeta no espectro
de cor, diferenciando com maior nitidez as bactérias Gram-negativas.
Procedimento
1. Cubra o esfregaço com cristal violeta e deixe por aproximadamente 1 minuto;
2. Escorra o corante e lave em um filete de água corrente;
3. Cubra a lâmina com lugol e deixe agir por aproximadamente 1 minuto;
4. Escorra o lugol e lave em um filete de água corrente;
5. Adicione álcool-acetona sobre a lâmina; descorando-a, até que não desprenda mais corante;
6. Lave em um filete de água corrente;
7. Cubra a lâmina com safranina e deixe agir por aproximadamente 30 segundos;
8. Lave em um filete de água corrente;
9. Deixe secar ao ar livre;
10. Coloque uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço;
11. Leia em objetiva de imersão (100 X).
Nenhum comentário:
Postar um comentário